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癌症研究中方興(xing) 未艾的免疫治療的思路主要包括免疫檢查點治療和細胞治療。這兩(liang) 種思路是從(cong) 提高免疫細胞功能的角度出發，為(wei) 患者輸注藥物去增加免疫力。能不能從(cong) 相反的角度出發，對於(yu) 一些影響免疫力的蛋白做一些“減法”治療，即去除這些蛋白。這種藥物研發在之前是難以實現的，或者說是“難以成藥” 。但隨著一些新的藥物研發策略的興(xing) 起，使這些蛋白有望成為(wei) 新的靶點。
南京醫科大學附屬第一醫院腫瘤內(nei) 科殷詠梅副院長團隊成員與(yu) 西北大學芬伯格醫學院羅伯特·盧裏綜合癌症中心的研究者剛剛在《Science Advances》雜誌（影響因子：14.957）上發表了一篇題為(wei) “Proteolytic Regulation of CD73 Orchestrates Tumor Immunogenicity”（調控CD73的蛋白水解可調節腫瘤免疫原性）的論文給出了新的腫瘤治療思路。文章提到，乳腺癌是導致婦女癌症死亡的第二大原因，對於(yu) 女性的健康造成很大的威脅。其中三陰性乳腺癌（TNBC）被認為(wei) 是一種“冷腫瘤”，對其治療選擇較少，也是侵襲性的乳腺癌形式，導致患者預後不良。在乳腺癌治療靶點的選擇上，除了免疫檢查點外，還存在CD73這類與(yu) 腫瘤微環境免疫功能相關(guan) 的蛋白。高水平的CD73與(yu) 較差的預後相對應。與(yu) 此同時，三結構域（TRIM）蛋白也與(yu) 免疫調節和腫瘤發生有關(guan) 。TRIM蛋白本質上是蛋白質降解途徑的一部分，在其中它們(men) 發出某些蛋白質的降解信號。先前的研究表明，TRIM21水平與(yu) 疾病進展相對應，但迄今為(wei) 止，它與(yu) 癌症免疫原性的關(guan) 聯仍不清楚。
圖1：TRIM21low/CD73high的特征與(yu) 不利的免疫反應相關(guan)
IsoPlexis（NASDAQ: ISO）公司總部位於(yu) 美國的康涅狄格州，是一家專(zhuan) 注於(yu) 單細胞功能蛋白質組分析解決(jue) 方案的供應商。作為(wei) 單細胞多組學的重要組成部分，IsoPlexis單細胞技術已被國內(nei) 外用戶廣泛認可，包括高校科研機構、全球Top 20的製藥企業(ye) 、70%美國綜合性癌症中心等，在臨(lin) 床科研領域，針對評估和檢測人體(ti) 單細胞免疫能力、篩選癌症治療方案、預測評估臨(lin) 床療效及安全性等方麵有著豐(feng) 富的成功經驗，為(wei) 預測病人長期生存、早期篩選治療獲益患者提供了詳實的參考數據，加速藥物研發上市及聯合療法開發應用。
通過使用IsoPlexis的檢測技術，各地的研究人員在Cell、Nature Medicine、Immunity、Journal of Clinical Oncology、Cancer Cell等高影響力期刊上發表多篇高分文章，並在腫瘤免疫、細胞治療、腫瘤學、抗感染免疫研究及疫苗開發、自身免疫病、移植免疫等方向取得了眾(zhong) 多突破性成果，應用於(yu) 疾病發病和耐藥性機製研究、生物工藝優(you) 化、預測及評估免疫相關(guan) 不良反應的新型生物標誌物，助力加速醫學和生命科學行業(ye) 發展。
研究思路
研究者證實了CD73的高表達與(yu) 所有乳腺癌分類中較低的生存率相關(guan) 。然後，他們(men) 通過一些分子生物學技術揭示了CD73水平經曆了一種被稱為(wei) 泛素化的翻譯後修飾。泛素化本質上是蛋白質的一種降解信號。通過分子生物學技術和質譜技術的結合發現這種蛋白水解信號的驅動因素是TRIM21。接下來，鑒定TRIM21作為(wei) 控製CD73蛋白降解以調節T細胞功能的潛在泛素E3連接酶。
泛素化的關(guan) 鍵是泛素肽附著（或連接）到賴氨酸殘基上。該小組試圖找出哪些賴氨酸殘基可能是CD73蛋白被泛素化的賴氨酸。他們(men) 鑒定了以下賴氨酸作為(wei) 泛素化位點：K133、K208、K262和K321。為(wei) 了確定這些賴氨酸對TRIM21介導的CD73降解的重要性，作者將這些特定殘基突變為(wei) 精氨酸，理論上會(hui) 阻斷泛素化，得到多個(ge) 突變TNBC細胞係：MDA-MB468-CD734KR（這4個(ge) 賴氨酸殘基均突變為(wei) 精氨酸），MDA-MB468-CD73K133R/K208R（K133和K208的賴氨酸突變為(wei) 精氨酸），MDA-MB468-CD73K262R/K321R（賴氨酸K262和K321突變為(wei) 精氨酸）。
IsoPlexis檢測方法
將MDA-MB468-CD73WT或MDA-MB468-CD734KR分別用APCP（CD73抑製劑）或不加APCP處理24小時，使用腫瘤條件培養(yang) 基培養(yang) 。收集突變TNBC細胞培養(yang) 上清液。供體(ti) PBMCs加入收集的上清液，使用anti-CD3刺激，培養(yang) WT/No APCP、4KR/No APCP、WT/APCP或4KR/APCP四組細胞。在孵育72小時後，作者評估了供體(ti) PBMC分選的CD8+T細胞的多功能性和細胞多功能指數PSI。
研究者發現，與(yu) WT細胞的T細胞相比，加入突變細胞係培養(yang) 上清的T細胞多功能和多功能指數總體(ti) 耗盡。並且有趣的是，與(yu) 未經APCP處理的T細胞相比，經APCP處理的T細胞的多功能性和PSI似乎略有增加（圖2）。
圖2：IsoPlexis檢測CD73及其泛素化位點突變
對於(yu) 免疫細胞功能的影響
這意味著靶向CD73，通過增強其降解或簡單抑製其功能可能是增強免疫功能的可行選擇。他們(men) 也進行了進一步檢測以明確起關(guan) 鍵作用的泛素化位點，培養(yang) MDA-MB468-CD73K133R/K208R和MDA-MB468-CD73K262R/K321R（圖3），評估其培養(yang) 上清對於(yu) CD8+T細胞多功能和PSI的影響，結果顯示，K262和K321突變組的細胞多功能性和PSI均顯著降低，表明K262和K321是TRIM21介導CD73泛素化降解的關(guan) 鍵賴氨酸位點。
圖3：IsoPlexis檢測確定起關(guan) 鍵作用的泛素化位點
此外，研究發現，當用IFNɣ處理MDA-MB468細胞時，TRIM21水平顯著升高，CD73水平顯著降低。這表明，像CD8+T細胞這樣的IFNɣ分泌細胞的存在創造了一個(ge) 反饋回路，從(cong) 而提高腫瘤細胞中的TRIM21水平，進而耗盡CD73水平。最後，本文總結了小鼠和患者的體(ti) 內(nei) 數據，探討了TRIM21水平如何與(yu) 小鼠模型腫瘤負荷和患者更有利的免疫信號相關(guan) 。總之，作者闡明了CD73如何促進TNBC的免疫逃避的機製，同時也揭示了CD73可以通過TRIM21進行調控的機製。最終，這些數據為(wei) 靶向CD73以提高免疫療法和其他類型的治療方法的有效性提供了一個(ge) 案例。
文章點評
文章點評
#1
在免疫檢查點治療策略之外，對付癌症的“wuqi庫”永遠需要新的選項，評估這些選項的標準是什麽(me) ？是用了很多年的檢測方式，還是研究人員比較“熟悉”的一些諸如濃度、成像、亞(ya) 群等指標，抑或是“其他人”也在做的實驗方法。我們(men) 認為(wei) 答案是否定的，需要用事實說話，臨(lin) 床轉化研究中的事實就是能否與(yu) 臨(lin) 床結果建立相關(guan) 性，這也是單細胞蛋白組技術對於(yu) 臨(lin) 床轉化及前期基礎研究的意義(yi) 。
IsoPlexis平台提供了評估免疫功能的標準，從(cong) 而更好地確定治療策略是否有效，如為(wei) CD73等新靶點評估提供決(jue) 定性的根據。
#2
#3
與(yu) 免疫檢查點和細胞治療不同，新的泛素依賴的藥物研發路徑使之前“難以成藥”的蛋白成為(wei) 新的靶點。要評估蛋白對於(yu) 免疫微環境的影響，需要去檢測免疫細胞的免疫功能的變化，需要對於(yu) 活的免疫細胞進行刺激，並且避免由於(yu) 免疫細胞的功能異質性而隱藏的重要信息，所以需要使用單細胞層麵的功能蛋白組檢測，這使得單細胞功能蛋白組技術成為(wei) 這類研究的不二zhixuan！
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